
共聚焦显微技术是近十几年迅速发展起来的一项高新研究技术,目前应用领域扩展到细胞学、微生物学、发育生物学、遗传学、神经生物学、生理和病理学等学科的研究工作中,成为现代生物学微观研究的重要工具。随着计算机、图像处理软件以及激光器的发展,共焦显微镜现已广泛应用于生物学、微系统和材料测量领域中。共焦显微镜是集共焦原理、扫描技术和计算机图形处理技术于一体的新型显微镜,其主要优点为:既有高的横向分辨率,又有高的轴向分辨率,同时能有效抑制杂散光,具有高的对比度。
共聚焦显微镜利用放置在光源后的照明针孔,和放置在检测器前的探测针孔,实现点照明和点探测,来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上,该点所发射的荧光成像在探测针孔内,该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的,因此被探测点即为共焦点,被探测点所在的平面即为共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上,为了产生一幅完整的图像,由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描,从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动,将样品新的一个层面移动到共焦平面上,样品的新层面又成像在显示器上,随着Z轴的不断移动,就可得到样品不同层面的连续光切图像。

共聚焦显微镜的系统点扩散函数分布等于物镜和点像能量分布的卷积。在物镜相同的情况下,其横向分辨率(x-y面)比传统光学显微镜提高了1.4倍。从共焦显微镜的原理可知,探测器处针孔的设置不仅有效抑制了离焦面点像对检测平面像的干扰,同时抑制了准焦面上非探测点对探测点的干扰,极大地改善了图像的分辨率。此外,为了实现极高分辨率,共焦显微镜系统必须配备防振工作台。
传统光学显微镜上常配备CCD相机来采集图像,但由于CCD的灵敏度比较低,对于低照度的光,如荧光无法探测到,因此在共焦显微镜系统中一般使用光电倍增管作为探测元件,其灵敏度大大超过CCD,对微弱的荧光信号也可以呈现出很高的灵敏度。
共焦显微镜系统所展现的放大图像细节要高于常规的光学显微镜。此处所说的放大不是指物理上的放大,而是指在相同物镜放大的条件下,共焦显微镜所展示的图像形态细节是在传统光学显微镜下很难看到的,因而图像更清晰更微细,横向分辨率更高。
由于物体照明光仅是扫描中一个非常小的聚焦光点,且亮度、信噪比高,信号光要比物体其他点要强。在像面上,点探测器只能接收通过针孔的光,而来自物体其他部位的杂散光因在共焦针孔处不能聚焦而被滤除。这使得通过共聚焦扫描显微镜得到的样品图像对比度比传统显微镜的要高。
随着共焦显微技术的发展,出现了一些新的技术,进而出现了很多新结构的共焦显微镜。而宽视场共焦显微镜即为有代表性改进之一。
多年来,提高数据获取速度的一直是影响共焦显微技术推广应用的主要障碍。而采用改变共焦孔径的方法即是大家努力的方向。如图2所示,如果用微透镜阵列来取代物镜,则能够实现大(宽)视场的检测。当每一个独立的微观透镜保持较大的NA时,视场由阵列的大小决定。单个透镜的焦距可以用于调节来适应被测对象的形状,减少扫描范围和加快速度。用微镜头代替物镜的系统与典型的共焦显微镜有一点不同,因为光被微透镜焦平面上的每一个物点反射,然后通过透镜聚焦在一个针孔上,该针孔相当于一个空间滤波器。微透镜的光瞳将在相机上成像,而不是像典型的共焦装置的像点。对于这个系统,当物镜NA等于0.3时,轴向分辨率能达到50mm

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